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技術(shù)文章

科學家研究繪制蛋白質(zhì)相互作用圖像了解**起因

1987年，瑞士研究人員描述了兩個姐妹，她們分別出生但擁有類似的異常。她們小腦中缺失了一圈組織，心臟存在孔和裂縫。其中1人在心臟手術(shù)后于三歲去世，她的姐姐在四歲時也做過類似的手術(shù)，但活了下來。因為兩名女孩的父母都沒有這些異常，研究人員得出結(jié)論，他們的女兒繼承了一種非典型基因的兩個復本，導致了此前不為人知的一種癥狀。

與女孩癥狀相關(guān)的核苷酸異常可能存在于一個單獨的基因中。然而，若干其他基因隨后也與這種被稱為“Ritscher—Schinzel綜合征”的基因聯(lián)系在一起。多年來，這些基因的功能以及它們?nèi)绾闻c該綜合征相關(guān)聯(lián)一直是個謎。

今天，由于對蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用—— 一門被稱為“相互作用組”的學科——的系統(tǒng)研究，這些分子基礎(chǔ)已經(jīng)成為關(guān)注的焦點。通過繪制蛋白質(zhì)之間的連接網(wǎng)絡(luò)，三個研究小組獨立發(fā)現(xiàn)了一個叫做“指揮官”的復合物，它由突變基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組成。“指揮官”是一個重要的細胞成分，可以對蛋白質(zhì)進行分類和傳遞，其功能失調(diào)就會導致存在嚴重缺陷的Ritscher–Schinzel綜合征。

過去3年里，研究小組已經(jīng)發(fā)表了**批高質(zhì)量人類相互作用組學圖像。對這些圖像的綜合已經(jīng)識別出約9.3萬個獨特的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。這并不容易：捕捉到所有的相互作用是一種挑戰(zhàn)，因為一組蛋白質(zhì)搭檔會隨著不同的組織、細胞甚至是時間而變化。相互作用組是動態(tài)的，會隨著細胞對環(huán)境的響應(yīng)而斷開或形成。完全繪制它可能需要思考系統(tǒng)生物學的新方式方法。盡管如此，這個領(lǐng)域仍在不斷產(chǎn)出成果。

數(shù)字游戲

有兩種構(gòu)建相互作用組圖譜的主要方式。酵母雙雜合化驗通過把基因表達與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用相結(jié)合，測試了蛋白質(zhì)對之間的相互作用。**種方法，通過用抗體分離復合物及用質(zhì)譜儀識別它們的組分繪制了直接和間接的蛋白質(zhì)接觸。

美國得克薩斯州立大學奧斯汀分校系統(tǒng)生物學家Edward Marcotte的實驗室在**種方法基礎(chǔ)上采用了一個變化，涉及在生物化學上分離蛋白（例如用蔗糖濃度梯度），從而觀察哪些分子傾向于呆在一起。由此產(chǎn)生的圖像讓Marcotte及其實驗室博士后Anna Mallam對“指揮官”復雜的細胞角色進行了推斷。那些數(shù)據(jù)和其他發(fā)現(xiàn)表明，“指揮官”會將特定蛋白質(zhì)從細胞膜轉(zhuǎn)移到被稱為高爾基體的空間里，它們在那里被循環(huán)利用。

目前，大的圖譜包含了成千上萬的蛋白質(zhì)，與放射狀的星暴相比，它們更加類似于纏結(jié)的毛球。通過解開這些基因，研究人員可以識別出區(qū)分致癌基因與“正常”基因的特征，還可以定義關(guān)鍵的生物學過程，如細胞分裂期間的染色體隔離。

馬薩諸塞州波士頓丹娜—法伯癌癥研究所計算生物學研究者Katja Luck說，即使有多種方法，相互作用組圖譜“仍然是不完整的”。這是一個關(guān)于數(shù)字的問題。人類基因組包含約兩萬個蛋白質(zhì)編碼基因。如果一個人假設(shè)每種蛋白質(zhì)只有一種形式（過于簡化的情況），那么大約有兩億種可能的相互作用。實際數(shù)字可能要小得多，因為許多交互都是間接的，一對一交互范圍估計在12萬到100萬之間。

從生物化學方面看，蛋白質(zhì)是的多樣化令人難以置信，因此它們之間的相互作用不能被每一次的試驗所捕獲。“我們只是剛剛開始理解不同方法的偏差。”Luck說。

基因剪刀
Luck是遺傳學家Marc Vidal實驗室的博士后，Vidal設(shè)想的參考圖可能只包含所有潛在的相互作用的子集。細胞和組織的變化以及改變細胞的反應(yīng)累積成為全部相互作用組的許多可能的版本。對德國馬普學會生物化學研究所生化學家Matthias Mann來說，這些變化令人畏懼。但他對用基因編輯技術(shù)的力量，如用CRISPR-Cas9解決這些問題表示樂觀。

Mann的繪圖方法涉及表達了數(shù)百種蛋白質(zhì)的細胞株庫，這些蛋白質(zhì)是通過一種叫作軌道阱的超高分辨率質(zhì)譜儀進行測試的。誘餌蛋白質(zhì)被融合到綠色熒光蛋白，產(chǎn)生一種光度輪廓，讓研究人員能夠通過活細胞成像量化相互作用。在21世紀頭十年后期，創(chuàng)建細胞株庫“相當費力”，他說。“現(xiàn)在，由于有了CRISPR基因工程技術(shù)，我們的新方法獲得了雙翼。”

自從2010年引入該量化方法以來，Mann的團隊已經(jīng)繪制并量化了超過2.8萬個相互作用的強度。一對一比率的蛋白質(zhì)對的相互作用被認為是“強大”的，可能存在于穩(wěn)定和豐富的復合體中。Mann解釋說，如果沒有這樣的信息，“很難說這個網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)是怎樣的”。對他所在團隊繪制的圖譜進行的分析顯示，人類相互作用組由弱關(guān)聯(lián)主導，這可能反映了低豐度調(diào)控蛋白???更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)機器的作用。

細微調(diào)整
這一領(lǐng)域的普遍趨勢是采用相對溫和的樣品制備方法，其目的是真實地捕捉細胞中所有蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。“我們正試圖找到破壞性更低的方法。”加州圣荷西市生命科學公司賽默飛世爾科技公司生物化學家Rosa Viner說。該公司專注于改進樣品制備、工作流程和質(zhì)譜技術(shù)，目的是幫助研究人員識別細胞中存在的相互作用。“這是艱巨的挑戰(zhàn)：找到不需要任何人工現(xiàn)象的情況下讓我們獲得好的照片的方法。”她補充道。

人工現(xiàn)象包括在檢測到它們的相互作用之前就分解的蛋白質(zhì)復合物。為了把這些復合物凝聚在一起，Viner與加州大學歐文分校的研究人員合作，在質(zhì)譜分析之前在化學上融合復合物，這種方法叫作交叉連接。一種名為QMIX的策略（多路復用、等比重標記的交叉結(jié)合的肽的定量化）已被開發(fā)出來，它可以用化學標簽整合交叉結(jié)合的化合物，從而使研究人員能夠穩(wěn)定及跟蹤蛋白質(zhì)復合物。

好的分析會考慮到任何給定方法的盲區(qū)。“仍有一些蛋白質(zhì)種類非常具有挑戰(zhàn)性。”波士頓哈佛醫(yī)學院細胞生物學家Wade Harper說，“當進行高通量分析時，你會被限制在對單個蛋白質(zhì)有多關(guān)注上。”這樣的分析往往會對每個反應(yīng)進行相同的處理，幾乎沒有定制化的余地。

Harper和哈佛同事Steven Gygi創(chuàng)建了一個實驗室小組調(diào)整他們的方法。“我們的團隊規(guī)模相對較小，只有4到6人，每個月可以創(chuàng)建400到500個細胞株。”他說。這些努力迄今為止已經(jīng)通過單個通道產(chǎn)生了大量的人類蛋白質(zhì)復合物數(shù)據(jù)集。他們的譜圖名為“bioplex”，包含約12萬個相互作用。

更大圖景
但為了更近一步去看這些相互作用，研究人員必須深入研究細胞自身的擁擠情況。加拿大多倫多大學生化學家Anne-Claude Gingras使用一種名為BioID的技術(shù)，該技術(shù)基于蛋白質(zhì)的接近性將其連接到另一個蛋白質(zhì)上。相關(guān)的標記蛋白會給附近的蛋白添加化學標記，留下它相互作用的證據(jù)——就像一個揮動著彩筆蹣跚學步的孩童經(jīng)過房間時候留下的痕跡。其結(jié)果是一幅圍繞著初始蛋白的在物理上近鄰的圖像。Gingras解釋說，識別一個蛋白質(zhì)的更大社區(qū)可能揭示其細胞功能的細節(jié)。

近距離成像還可以讓研究人員跟蹤那些無法被其他試驗所發(fā)現(xiàn)的蛋白，比如難以分離的膜嵌入蛋白。Gingras說：“我們和其他研究人員研究了核染色質(zhì)上的蛋白，繪制了中心體的組織，探測出跨越各種膜之間的相互作用。”通過使用BioID，該小組在一個信號通路中發(fā)現(xiàn)了在發(fā)育過程中可調(diào)節(jié)器官大小的新組分。

Lippincott-Schwartz說，這種相互作用組是細胞生物學家的“假說生成器”。“一旦你看到一種認識的蛋白質(zhì)與一大堆你不知道其功能的蛋白質(zhì)相互作用時，你就開始進行測試。”隨著相互作用組圖像而終被高質(zhì)量、豐富的相互作用所充實，研究人員將能開始驗證那些假說。

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